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      穩定細胞系構建

      高表達穩定
      細胞株開發

      高表達穩定細胞株開發

      德泰生物提供哺乳動物穩定細胞系構建服務,與瞬時轉染不同,穩定細胞系構建是指外源基因進入受體細胞并整合到細胞的染色體上,使宿主細胞可長期表達目的基因,穩定細胞株表達的蛋白/抗體穩定性更好和批次差異性更小。

      穩轉細胞株篩選

      我們的穩轉細胞株篩選培養的是CHO細胞,針對我們自主研發的高表達proEM系統定向馴化的pro-CHO細胞,在重組蛋白生產過程中表現出很高的產能和細胞密度。pro-CHO還可以根據客戶特殊的培養基成分進行馴化。pro-CHO展示卓越的生長代謝特征,不管是在搖瓶,還是在wave或細胞罐中,其強勁的生長曲線為蛋白高產奠定了堅實的基礎。

      項目 服務內容 穩定細胞系
      構建周期
      最終交付 價格
      基因合成&亞克隆 密碼子優化&基因合成 ~4周 表達載體;
      測序報告;
      1株穩轉細胞株(2管/株,1×107cells/ml);
      詢價
      載體構建&質粒制備
      細胞轉染 細胞轉染 ~4周
      表達檢測(WB或ELISA)
      穩定細胞系構建 壓力篩選 ~2月
      穩轉細胞株篩選
      蛋白生產
      細胞凍存

      穩定細胞系構建 流程圖:

      穩定細胞系構建

      我們的優勢

      • 最新技術雙壓力proEM系統,全面提升高表達穩定細胞系建立成功率。
      • 嚴謹的細胞來源:細胞來源可追溯,商品化的培養基。
      • 寬廣的表達對象:重組單抗、蛋白、抗體或蛋白片段
      • 穩定高產:重組單抗可達2g/L,2-4×107cell/ml
      • 周期短:從DNA到細胞株只需要3-4個月
      • 全程技術支持

      穩定細胞系構建原理與方法

      查看全文:穩轉株篩選原理方法

      利用哺乳動物系統生產蛋白的方式有兩種:瞬時轉染和穩轉株篩選。通過穩定細胞系構建篩選穩定表達細胞株。針對瞬時轉染,外源基因在短時間轉錄翻譯得到的蛋白量較少,能夠滿足小量蛋白制備,大量生產成本很高。相對于此,穩定轉染的是將外源基因整合到細胞自身的基因組上,隨著細胞的生長分裂外源基因可以穩定轉染表達,同時經過抗生素加壓篩選,最終得到能夠穩定轉染表達蛋白的細胞株,穩轉株生產蛋白穩定性更好,批次差異性更小。


      穩定細胞系構建

      如圖,目的基因(紅)轉染至宿主細胞,通過一定的細胞轉染方法,可以獲得兩種結果。結果A:目的基因整合到了宿主自身的基因組上,此為穩定轉染,隨著細胞的生長復制,目的基因能夠穩定存在并表達,因此穩定轉染的細胞可以成功構建并篩選穩轉細胞株。

      B是目的基因被轉染到了宿主菌內,但是未整合到宿主自身基因組上,此為瞬時轉染,目的基因只能短期快速表達,隨著細胞的不斷生長分裂,目的基因最終丟失。


      細胞轉染方法比較

      細胞轉染方法 細胞轉染原理 主要特點 主要特點
      陽離子脂質體轉染法 帶正電荷的脂質體靠靜電作用和DNA結合形成DNA-脂質體復合物,然后通過細胞的內吞作用進入細胞 a)操作簡便
      b)適用于各種裸露的DNA和RNA片段
      c)適合轉染各種的細胞
      d)對DNA濃度有一定要求
      e)對細胞有一定的毒性
      瞬時轉染
      穩定轉染
      所有細胞
      磷酸鈣法 磷酸鈣能夠促進外源DNA和細胞的結合,磷酸鈣-DNA復合物能夠附著到細胞表面,并通過內吞作用進入細胞 a)操作簡單
      b)對DNA濃度要求高
      c)適用性有局限(不適用于原代細胞)
      瞬時轉染
      穩定轉染
      電穿孔法 高脈沖的電壓破壞細胞膜,在細胞膜表面形成孔道,DNA通過孔道進入細胞 a)適用性廣,適用于質粒和幾十kb的基因組片段
      b)針對不同細胞要優化實驗條件
      c)細胞致死率較高
      瞬時轉染
      穩定轉染
      所有細胞

      穩轉細胞株篩選流程

      細胞復蘇

      細胞復蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細胞株解凍并重新培養的過程。細胞復蘇的關鍵是快復,防止在解凍過程中,產生的水珠形成冰晶損傷細胞。細胞復蘇一般步驟如下:

      • 預先加熱水浴鍋,溫度至37-40℃,并在離心管中準備好10ml培養基;
      • 從液氮罐或冰箱中取出細胞,迅速放進預熱的水浴鍋中,鑷子夾住凍存管晃動,使其受熱均勻;
      • 當凍存管內完全融化時,注意用酒精擦拭凍存管消毒,將液體倒入含有10ml培養基的離心管中;
      • 離心5min,去除上清,得到沉淀;
      • 用培養基懸浮沉淀,并接種到培養瓶常規培養。

      細胞復蘇后,生長一段時間,95%的細胞貼壁生長,細胞狀態良好,說明細胞復蘇成功。

      細胞轉染

      以脂質體轉染為例的操作流程。

      • 將復蘇后常規培養的細胞按照1-3×10^5接種到6孔板中,加入2-4ml的完全培養基,混勻放置在二氧化碳培養箱中37℃過夜;
      • 無菌狀態下配置如下溶液:a 用100ul的無血清培養基稀釋2ug的待轉染的質粒; b 用100ul的無血清培養基稀釋25ul的Lipofectamine轉染試劑(血清的存在會影響轉染效率,因此要使用無血清培養基轉染)
      • 將ab溶液混合并搖勻,室溫下放置30min左右;
      • 細胞培養至80%單層左右,用無血清培養基洗滌細胞2次,每孔加入1ml的無血清培養基,并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔,按十字方向輕搖混勻,二氧化碳培養箱中37℃培養24小時;
      • 將轉染液倒出,換為完全培養基繼續培養。

      穩轉株篩選

      24-72h加入選擇性抗生素進行穩轉株篩選,預實驗確定抗生素的最佳濃度,確定抗生素對所選細胞的最低作用濃度。

      查看全文:穩轉細胞株篩選實驗流程

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